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      退火溫度

      補充:0  瀏覽:12091  發布時間:2013-7-3
        退火溫度(Annealing Temperature)[1] 為引物和模板結合時候的溫度參數,當50%的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度.它是影響PCR特異性的較重要因素。在理想狀態下,退火溫度足夠低,以保證引物同目的序列有效退火, 同時還要足夠高,以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的 Tm低5℃。
        在模板變性后溫度快速冷卻至40℃~60℃(某個退火溫度)的時候,可使引物和模板發生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多,引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞,這就使PCR后期的過程成為可能。
        退火溫度與時間,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度:
        Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T)
        復性溫度=Tm值-(5~10℃)
        在Tm值允許范圍內, 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合, 提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30~60sec,足以使引物與模板之間完全結合。
        在金屬加工領域,退火溫度是指退火時金屬應加熱達到的溫度。據有關文獻介紹,不同金屬材料的退火溫度為:鉑,900—1000℃;銅,650℃;黃銅,600—650℃;鎳銀,650—680℃;鋁,283—350℃等。

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